Timóteo recebeu seu nome, que significa "aquele que honra a Deus", de sua mãe Eunice e sua avó Lóide, judias devotas que se tornaram crentes no Senhor Jesus Cristo (2 Timóteo 1.5) e ensinaram a Timóteo as Escrituras do Antigo Testamento desde a sua infância (2 Timóteo 3.15). Seu pai era grego (Atos 16.1), que pode ter morrido antes de Timóteo conhecer Paulo.
Timóteo era de Listra, uma cidade na província romana da Galácia, parte da Turquia moderna. Paulo levou Timóteo a Cristo, indubitavelmente durante seu ministério em Listra na primeira viagem missionária (Atos 14.6–23). Quando voltou a visitar Listra em sua segunda viagem, Paulo escolheu Timóteo para acompanhá-lo (Atos 16.1–3). Embora fosse muito jovem, provavelmente no fim da adolescência ou com seus 20 e poucos anos, ele já tinha a reputação de ser piedoso (Atos 16.2).
Timóteo seria discípulo, amigo e colaborador de Paulo pelo resto da vida do apóstolo, tendo ministrado com ele em Bereia, Atenas, Corinto, e o acompanhado na viagem a Jerusalém. Esteve com Paulo em sua primeira prisão em Roma e foi para Filipos depois da libertação do apóstolo. No Novo Testamento, Timóteo é referenciado 28 vezes.
De acordo com o Livro dos Mártires de John Foxe, Timóteo morreu em 97 d.C. defendendo a verdade da Bíblia. Durante uma celebração pagã, repreendeu severamente a procissão por sua idolatria; os participantes da festa o espancaram de tal modo que ele expirou das contusões dois dias depois.